客製化抗體製備流程 (Custom Antibody Procedure)

對於需要客製化抗體開發的研究人員來說，了解抗體製備的細節流程是首要關切的問題。Apical Lab 憑藉著本地的實驗室與動物房設施，透過與客戶深入的討論及嚴格的樣品驗證，確立各階段的品質控制點，從而確保客製化抗體開發的高成功率。
Custom antibody development hinges on knowing the detailed antibody preparation process. Apical Lab boosts success rates by closely collaborating with clients, enforcing strict sample checks, and establishing quality control at every step, backed by extensive experience.

Overview

客製化抗體開發的時程依據專案進展有所不同。一般來說，兔多株抗體的開發需時約 4 至 5 個月，而鼠單株抗體的開發則需要 6 至 8 個月。對於涉及重組抗體的專案，於完成兔、鼠多株抗體開發流程後，須額外增加約 3 個月的時間。Apical Lab 客製化抗體具體的服務內容可參考文章「客製化抗體」。

開發流程圖如下：

一、抗原設計

客製化抗體開發的關鍵，在於精確無誤的抗原設計。Apical Lab 運用 AI 輔助工具，細緻分析蛋白質的三級結構，評估胺基酸的各項特性，包括親疏水性、免疫反應能力與特異性，提供科學的抗原設計方案。有關抗原設計的原理與方法，請參閱專題文章：「抗原設計原理」。

一般來說，抗原以胜肽或蛋白質的形式存在。然而，細菌、細胞等生物質在透過固定以及去活化的處理後，亦可作為抗原進行抗體製備。

抗原設計的步驟，由客戶提供標的資訊，例如 Accession Number 後，即可完成。

二、抗原製備

通常，採用胜肽作為抗原是一個相對簡便與快速的方法。確定序列之後，便可以開始製作胜肽，整個過程需時約 30 天。而若選擇使用蛋白質作為抗原，客戶可提供相關的質體，或由 Apical Lab 直接進行質體的全基因合成，隨後展開蛋白質的表達及純化專案，整體所需時間可能超過60天，具體取決於蛋白質開發的進度。

對於希望使用細菌、細胞等生物質為抗原的情形，則可以提供去活化的樣本，並由 Apical Lab 完成乳化等後續處理，以製備抗原。

三、動物免疫

動物免疫反應的基礎在於誘發特異性的後天免疫機制，從而促使 B 細胞製造出抗體。在此過程中，除了免疫動物本身的生理差異之外，佐劑的選取與應用方法亦扮演著關鍵角色。

在抗體生產過程中，常見的佐劑包括弗式完全佐劑（Freund’s complete adjuvant）、弗式不完全佐劑（Freund’s incomplete adjuvant）、Ribi、Titermax gold、鋁鹽（Aluminum salts）等。由於各類佐劑成分的不同，對免疫反應的誘發作用也有所差異，尤其是弗式完全佐劑，因含有去活化的結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）與乳酪分枝桿菌（Mycobacterium butyricum）的生物質，會強烈地激發免疫反應，但也會導致一定程度的組織損傷及生理疼痛，讓動物產生壓力。因此，在使用弗式完全佐劑時，要相當的謹慎。

另一方面，免疫完成後的抗體效價，可通過 Dot blot 或 ELISA 與免疫抗原進行半定量或定量的檢測，以及藉由測量平衡解離常數（Kd值）來分析抗體與抗原結合的強度與穩定性。Kd值越低，表示抗體與抗原之間的結合親和力越高，相互作用越穩定。一般來說，實驗白兔產生的免疫反應 Kd 值落在 10^-10 到 10^-11 範圍內，大約是小鼠反應強度的 10 ~ 100 倍。

Apical Lab 採行的標準動物免疫程序，以 2 隻實驗用白兔或 5 隻小鼠作為免疫對象，通過縝密調整且經過反覆驗證的抗原劑量及佐劑配方進行操作，目的在於對動物體內誘發穩定抗體生成的同時，減少對動物造成不必要的傷害或疼痛感。我們的動物免疫流程已獲相關動物管理委員會的審核與批准，並在專業技術人員的操作及獸醫的嚴格監督下進行，以確保實驗的科學性與動物的福祉。整體過程大約是 90 天完成。

四、鼠單株製備 (兔多株可略過)

若是選擇小鼠單株抗體製備，在確認小鼠經過免疫後產生的多株血清對指定抗原具有效價後，即可進行小鼠單克隆抗體的製備工作，此過程包含測試抗原，預計需要 60 天的時間。

單株化的過程，第一步是將免疫小鼠的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞以聚乙二醇（PEG）作為促進劑進行融合 (Fusion)。融合後的細胞培養在含有 Hypoxanthine、Aminopterin、Thymidine（簡稱HAT）的培養基中。此培養基專門用於消除那些未成功融合的骨髓瘤細胞。在培養過程中形成的融合瘤細胞 (Hybridoma) 將會生產並釋出抗體到培養液中。於是便能從培養液中篩選出具有特異性識別目標抗原的陽性融合瘤細胞。

最後，透過限制稀釋法（Limited Dilution）對篩選出的陽性融合瘤細胞進行培養，讓多孔盤中的每個培養孔中所生長的細胞，均是源自於單一顆融合瘤細胞，確保單克隆 (Hybridoma clone) 的形成，與其抗體製備。

五、抗體生產與純化

在生產多株抗體的過程中，完成動物免疫後，即可在不影響動物健康的前提下抽取血液，以收集血清。隨後透過親合性管柱 (Affinity Column) 從血清中純化出對特定抗原有專一性的抗體。一般而言，從一隻免疫後的兔子可以獲得約 3~5 mg 的純化抗體，這些抗體足夠進行數百至上千次的西方墨點（Western Blot, WB）或免疫組織化學染色（Immunohistochemistry, IHC）實驗。

另一方面，單株抗體的生產則可透過體外細胞培養（in vitro）或體內腹水生產（in vivo）的方式進行。在純化過程中，常用 Protein A/G 管柱來進行高品質的抗體純化，產量視投入的 Culture Sup 或腹水而異，通常亦為 3~5 mg。

集血與純化的步驟一般合計約需 15 天。

六、重組抗體

傳統抗體的批次變異性是很高的，特別因多株抗體的批次生產需要重新進行動物免疫，因此造成每批產生出來的抗體專一性以及結合力都不同。即便使用小鼠製造單株抗體，因單克隆融合瘤細胞本身就是基因體不穩定的癌細胞，再批次生產時無論透過細胞培養放大，或者再次打回動物以腹水方式取得，亦時常因有基因變異 (Genetic drift) 造成抗體特性的改變。因此，將抗體轉變為以 DNA 質體的形式存在，並透過重組蛋白的生產的技術進行抗體製備，便能徹底解決批次變異的問題！同時也確保抗體的品質與穩定供應！

在兔多株抗體製程結束後，我們可以開始進行抗體的重組化步驟。此過程從採集免疫動物的周邊血開始，從中收集 B 細胞，並利用噬菌體展示 (Phage Display) 等重組技術，篩選出針對特定抗原反應的 B 細胞抗體變異區部位的基因，完成重組抗體的製造。這個過程一般需要 60 ~ 90 天來完成。

對於小鼠單株抗體的製備而言，，則是在獲得單克隆融合瘤細胞之後，利用聚合酶鏈反應（PCR）技術，將抗體變異區基因克隆到含有特定物種抗體骨架的表達質體中。整個過程大約僅需 30 天，相對簡單且迅速。

無論是兔源或是鼠源的重組抗體，在獲得其表達質體後，便可以應用成熟的哺乳類細胞蛋白表達技術，穩定而持續的生產目標抗體。

客製化抗體製備的檢查點 (Checkpoints)

在抗體製備的過程中，進行多階段的檢查測試是極為關鍵的步驟。Apical Lab 提供的客製化抗體製備服務中，我們在免疫階段以及最終抗體純化前會向客戶提供動物的血清樣品，於客戶端進行實際的應用測試。這些測試不僅確保了抗體製備和篩選過程符合客戶的最終應用需求，同時也在這些關鍵檢查點評估專案是否需要繼續進行，從而大幅提高了最終的成功率。

常見的客製化抗體服務問題

Important Facts about Custom Antibody Production Service