蛋白標籤 (Protein Tag)
選擇適合的蛋白標籤不但有利於重組蛋白質的表達、增加蛋白質的可溶性、方便進行純化，並能結合抗體應用讓後續標記能更加精確！Apical Lab 整理常見蛋白標籤的特性，讓您快速掌握重組蛋白質開發的關鍵第一步！
The application of protein tags allows for faster and more precise expression, purification, and labeling of recombinant proteins. Apical Lab has compiled the characteristics of common protein tags, enabling you to quickly grasp the crucial first step in the development of recombinant proteins!
為什麼要使用蛋白標籤？
蛋白標籤 (Protein Tag) 對蛋白質表現與應用扮演非常重要的角色。通常在蛋白質表現第一個步驟，也就是建立 DNA 表達質體時，就需要選定適用的蛋白標籤，並且以融合表達 (in-frame fusion) 的方式與目標蛋白質連結，或者利用切位橋接 (cleavable linker) 的方式，在目標蛋白與標籤間嵌入酵素切點，以利後續進行標籤移除 (tag removal)的操作。 蛋白標籤的使用通常為達成以下目標：
增加重組蛋白質的產量與穩定性：
擁有完整二級結構與高水溶性的蛋白標籤，例如 GST tag、MBP tag 或 IgG Fc tag，能幫助目標蛋白正確的折疊，促進結構穩定性，增加溶解度，並且能有效的解決目標蛋白質在表現過程時可能出現沉澱而產生不規則蛋白聚集物 (inclusion body) 的問題。
方便蛋白質純化：
如蛋白標籤對純化樹脂或抗體具有特異的結合親和性，可以讓蛋白質純化變得非常快速且有效。特別以小片斷存在的多肽，例如 His tag、HA tag、Myc tag，與 DDDDK (FLAG) tag 等，本身分子量小，不會甘擾融合蛋白質的折疊，能保留其結構與功能，並且能以成熟的純化技術與條件進行大規模的生產。
進行目標蛋白質的追蹤與標記：
部份蛋白標籤以利於蛋白質追蹤與標記為目的，例如螢光蛋白標籤 (fluorescent protein tag)、冷光酶 (luciferase)、Dig tag、HRP tag 等。這類型的蛋白標籤通常自身帶有標記特性，或者可以通過酵素反應產生可偵測的訊號，用以(半)定量目標蛋白質的存在。此外，使用抗體進行免疫標記的操作，大部份的蛋白標籤也能達到類似的目的。
以主要目的分類蛋白標籤
GST tag, MBP tag, IgG Fc tag,
His tag, Ha tag, Myc tag, DYKDDDDK (FLAG) tag, AVI tag
Fluorescent Protein (ex. EGFP, DsRed, Dylight etc.), Luciferase, Dig tag, HRP tag, AP tag
常見的蛋白標籤介紹
以下介紹一些 Apical Lab 在為客戶進行客製化蛋白質開發與生產時，常遇見使用的蛋白標籤：
6x His Tag
His tag 通常是由連續六個以上組胺酸 (Histidine) 組成的短片斷多肽，分子量 (Molecular Weight) 約為 0.8 kDa。His tag 最初在 1988 年由 Roche 發表於 Nature Biotechnology，隨後 Qiagen 將其應用於蛋白質表現質體上。由於其簡單與容易操作的特性，能廣泛應用在蛋白質工程上，是目前商業與學術研究上最常用的蛋白標籤之一。
| 特性分類 | |
|---|---|
| 分子量 | 0.8 kDa (6x His) |
| 純化管柱 | Nickel columns, cobalt columns, or zinc columns. |
| 優勢 | 分子量小，不影響表現蛋白質的結構與功能。且本身不會造成不規則蛋白聚集物 (inclusion body) 的產生。 |
| 限制 | 在哺乳類動物細胞或昆蟲細胞上，可能出現較高的訊號干擾(高背景值)。 |
| 序列 | HHHHHH |
Glutathione-S-transferase (GST) Tag
GST tag 的分子量 (Molecular Weight) 為 26 kDa，是一個由 211 個胺基酸組成的蛋白標籤。GST tag 在 1988 年由 Smith＆Johnson 成功應用於蛋白質純化後，逐漸普及到現今許多的蛋白質工程上。一般而言，GST tag 接合到融合蛋白質的 N 端，並利用 GST 與 Glutathion 的高親和力特性進行純化。而由於 GST tag 是一個相對較大的分子，為避免 GST tag 影響到融合蛋白質的功能，可在表現質體設計中，在 GST tag 與融合蛋白之間加入切位橋接 (cleavable linker)，於蛋白純化後將 GST tag 切除。
| 特性分類 | |
|---|---|
| 分子量 | 26 kDa |
| 純化管柱 | Glutathione column |
| 優勢 | 能有效的提高融合蛋白的溶解度與結構穩定度，避免表達過程中產生不規則的蛋白聚集物 (inclusion body)。 |
| 限制 | 因 GST tag 本身分子量較大，可能影響融合蛋白質的折疊，對其功能產生影響。 |
| 序列 |
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYID GDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKV DFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFK KRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSD |
Maltose-binding Protein (MBP) Tag
MBP 標籤的分子量為 42.5 kDa，是一個由 370 個胺基酸組成的蛋白標籤（mature form）。MBP 蛋白是大腸桿菌（E. coli）中 MalE 基因所轉譯出的原生蛋白，本身參與細菌中的醣代謝功能。由於其具有高親水性，以及對於澱粉糖 (Amylose) 和麥芽糖 (Maltose) 的親和性，作為蛋白標籤可有效提升融合蛋白的溶解度、穩定性，以及純化的便利性。然而，由於 MBP 是一個相當大的分子，除了影響融合蛋白的結構與功能外，亦可能遮蔽融合蛋白質與其他分子的結合區。通常在融合蛋白質純化後，會切除 MBP tag 以降底上述情況發生的機會，但需要注意切除後可能導致蛋白質失去親水性而沉澱。
| 特性分類 | |
|---|---|
| 分子量 | 42.5 kDa |
| 純化管柱 | Amylose Columns |
| 優勢 | 特別針對 E. coli 表現系統使用的蛋白標籤，能大幅提高融合蛋白的溶解度與穩定性。 |
| 限制 | 分子量相當大，可能影響融合蛋白質的功能，以及純化效率。 |
| 序列 |
MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDI IFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNK DLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIK DVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSK VNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPL GAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDE ALKDAQTRITK |
Myc Tag
Myc tag，或稱為 c-Myc tag (cytoplasmic Myc) 的分子量 (Molecular Weight) 為 1.2 kDa，是由轉錄因子 Myc 蛋白質的第 410 到第 419 個胺基酸組成的短片斷胜肽。一般市售 Myc 抗體的辦視位點，如為上述位置，則多作為 Myc-tag 抗體使用。由於 Myc tag 分子量小，當其作為蛋白標籤時，不影響蛋白質表現時的折疊，也可與融合蛋白進行共同結晶，進一步解析結構
| 特性分類 | |
|---|---|
| 分子量 | 26 kDa |
| 純化管柱 | Glutathione column |
| 優勢 | Myc tag 能應用到不同的分析方法上。除了結晶解結構外，亦常用在 Western blot, IP, Flow 等實驗中，以研究蛋白質生物特性。 |
| 限制 | 使用 Myc tag 在純化時，需用到酸性液體溶解蛋白，可能會影響到純化後蛋白質的功能。 |
| 序列 | EQKLISEEDL |
Fluorescent Protein Tags
螢光蛋白標籤 (Fluorescent Protein Tags)，例如綠色螢光蛋白 (Green Fluorescent Protein，GFP)、DsRed、tdTomato 等，是生物學研究相當常使用的工具。不同於一般蛋白標籤，螢光蛋白標籤的使用最大特色，是能進行活體細胞分析，結合各類型螢光顯微設備，可在細胞、組織、系統甚至個體層次中標定與追縱特定蛋白表現。
| 特性分類 | |
|---|---|
| 分子量 | GFP: 27 kDa, DsRed Monomer: 26 kDa, DsRed Tetramer: ~100 kDa, tdTomato Monomer: 27 kDa, tdTomato Dimer: 54 kDa |
| 純化管柱 | 通常不用於純化 |
| 優勢 | 可用於活體影像系統，以追縱特定蛋白標記。 |
| 限制 | 需搭配螢光或雷射設備，花費成本較高。 |
| 來源 | 主要由海洋螢光生物 (例如 水母、海葵) 中分離後克隆，或者再經由人工修飾以增加螢光強度與穩定性而得。 |
如需要進行標籤移除，減少蛋白標籤對後續應用的影響，則可以在蛋白標籤與融合蛋白間加入切位，並使用酵素切除。常見的切除酵素包括：Enterokinase (切除 FLAG tag)、SUMO Protease (ULP1; 切除 SUMO tag)、TEV Protease (切除 linker: ENLYFQ^S )、3C Protease (切除 linker: ETLFQ^GP)、Thrombin (切除 linker: LVPR^GS)。
重要的蛋白標籤應用問題
Important Facts about Protein Tags
要怎麼選擇適合的蛋白標籤？
在使用蛋白質標籤時，需要充分了解所選用標籤的特性，並考慮到後續研究中使用的相關工具。舉例來說，當使用 FLAG tag進行親和力純化時，必須考慮到 Anti-FLAG 抗體的特異性。使用 HA tag 作為蛋白質標籤時，應注意到它容易被 Caspase T酵素切除，因此在細胞凋亡研究中應避免使用。螢光蛋白標籤在樣品中通常不會因 PFA（固定劑）的加入而失去螢光功能，但如果使用甘油等有機化學試劑，則可能直接破壞蛋白質的結構，從而使螢光蛋白失去螢光能力。
可否同時使用兩個以上的蛋白標籤？
當使用多個蛋白標籤組合時，可以獲得更多功能和靈活性的優勢。舉例來說，將 EGFP 與 His tag 組合使用，可以同時實現蛋白質的螢光標記和純化。EGFP 可以提供蛋白質在細胞中的可視化，使研究人員能夠追蹤和觀察其在生物系統中的定位和動態行為。而 His tag 則能夠通過金屬親和層析等技術對目標蛋白質進行高效的純化和檢測。這樣的組合可以同時獲得蛋白質的可視性和簡便的純化方式。
另一個例子是將 IgG Fc 與 AVI tag 結合使用。這種組合可以同時增加目標蛋白質的穩定性和水溶性。同時，AVI tag 具有與生物素結合的能力，通過與 biotin 的特異性結合，可以將目標蛋白質固定在特定的平台上。這樣的組合在快速篩選和開發蛋白質方面經常使用，既增加了目標蛋白質的穩定性，又能夠定向固定在所需的位置上。
無論為何目的使用蛋白標籤，Apical Lab 均建議能加入短序列 His tag ，並配合商售的純化管柱與抗體試劑，能在純化或追蹤操作上，大幅減低成本與加快實驗步驟。
蛋白標籤應該接在 N 端 或者是 C 端？
這沒有一定的答案，需要根據研究目標蛋白質本身的結構和實驗設計，來選擇正確的融合位點。例如，目標蛋白 N 端有 signaling peptide，則加入的蛋白標籤最好置於 C 端以免影響目標蛋白的合成與分怖。或者目標蛋白在後續實驗中需要利用蛋白標籤在 N 端進行相位位點的固定，那便只能將蛋白標籤置於 N 端。如沒有特別需求，實務上可以測試不同端點接合蛋白標籤，以找到最少影響目標蛋白特性的位點。