3Helix CHP 染色實驗步驟
Protocols for Using 3Helix’s Collagen Hybridizing Peptides (CHP)
CHP 保存與回溶
收到 CHP 粉末後可置於 -20°C保存至少一年以上。回溶前請輕拍瓶身使粉末落於底部，避免在打開時噴散出。製備 CHP Stock Solution 與 Working Solution 的方式如下：
1. 製備 100 μM的 Stock Solution：將CHP粉末溶於PBS中 (300 μg of CHP in 1mL PBS；60 μg of CHP in 0.2mL PBS)，震盪使其溶解後離心，並存放於4℃中三個月內使用完畢，或者存放於-20℃可保存一年以上。
2. 製備 Working Solution：以 PBS 將 Stock Solution 稀釋成適合的使用濃度 (第一次測試可以從 20μM 開始進行調整)。
注意事項
Working Solution 在加入樣本前，需進行前置處理：將 CHP Working Solution 放置於 80℃水浴槽(或加熱器) 5分鐘，後立即以冰水浴回溫至室溫。
實驗步驟 (Protocols)
石蠟或冷凍組織切片 CHP 染色實驗步驟
注意：如組織本身有較強列的自發性綠色螢光背景值，建議使用 R-CHP 或 B-CHP。詳細步驟可參考文獻: ACS Nano, 2017, 11, 9825–9835.
以標準方式去除切片上的石蠟或冷凍包埋劑(OCT)。
因 CHP 對組織的非特異性結合程度相當低，可以省略 Blocking 的步驟。然而，當 CHP 與抗體共同進行染色時，建議使用 10% Serum 或 5% BSA in PBS 進行 Blocking。注意：如使用 B-CHP，依組織特性可能需要進行內原性生物素阻斷的步驟。
以 PBS 稀釋 CHP 的 Stock Solution 製備成合適濃度的 Working Solution。根據樣本大小，一個組織切片可能需要 20 至 200 μL 的 Working Solution。注意：一般 CHP 使用的 Working Solution 濃度為5-30 μM，需依實驗狀況進行調整，建議初始濃度為 20 μM。
使用帶有溫度控制的加熱器或水浴槽，將 CHP Working Solution 在 80°C下加熱 5 分鐘（無需加熱 CHP Stock Solution）。加熱後立即將 CHP Working Solution 浸入冰水浴中 15-90 秒，使溶液冷卻至室溫。所需的冷卻時間取決於溶液體積。回溫後的 Working Solution 可以快速離心，以收集管內的凝結物，並迅速將 Working Solution 滴在每個組織樣本上（盡可能在冷卻後的1-3分鐘內完成）。
如有其他試劑使用，例如抗體，可與活化冷卻後的 CHP Working Solution 配製成含有 1% BSA 的 PBS 溶液進行共染。
將組織與染色溶液一起在 4°C 下反應至少 2 小時。為獲得最佳結果，建議反應過夜。
染色後，將組織切片在室溫下的 PBS 中洗滌 3 次，每次 5 分鐘。
使用螢光顯微鏡或共軛焦顯微鏡在 GFP 和 RFP 濾光片下分析以 F-CHP 和 R-CHP 染色的樣本。
- 對於使用 B-CHP 處理的組織，需通過 avidin / streptavidin 介導的方法檢測結合膠原的 CHP。可以將含有 0.005 mg/mL 的 streptavidin-conjugated chemical（例如，streptavidin-AlexaFluor 或 streptavidin-HRP）溶於 1％ BSA 的 PBS 中，加入樣本後於室溫下反應 1 小時。後續依標準步驟進行洗滌與檢測 (HRP 需進一步以化學沉澱方式顯色)。
- 如有抗體共同染色，可以將二級抗體稀釋於 1% BSA/PBS 中加入樣本後依標準步驟進行反應、洗滌與檢測。
3D 細胞培養 CHP 染色實驗步驟
詳細的實驗步驟可以根據特定的細胞類型和測試進行修改。詳細步驟可參考文獻: Biomaterials, 2018, 183, 67–76.
將 Rat Tail Type I Collagen 以醋酸溶液 (acetic acid; 4 mg/mL)、氫氧化鈉溶液 (NaOH; 0.34 N)、10x PBS 在冰上按 8:1:1 體積比例混合，而後加入 1×10^5 個細胞。將充分混合後的細胞基質混合物置入 8 孔細胞培養盤中 (150 μL/well)，並培養於 37 °C 細胞培養箱中進行凝膠。
於室溫中以 4% PFA/PBS 固定 3D 細胞凝膠 4 小時，後置於 PBS 中洗滌 2 小時，每 30 分鐘更換緩衝液一次。
因 CHP 的非特異性結合程度相當低，可以省略 Blocking 的步驟。然而，當 CHP 與抗體共同進行染色時，建議使用 10% Serum 或 5% BSA in PBS 進行 Blocking。
以 PBS 稀釋 CHP 的 Stock Solution 製備成 5 μM 的 Working Solution。使用帶有溫度控制的加熱器或水浴槽，將 CHP Working Solution 在 80°C下加熱 5 分鐘（無需加熱 CHP Stock Solution）。加熱後立即將 CHP Working Solution 浸入冰水浴中使溶液冷卻至室溫。回溫後的 Working Solution 可以快速離心，以收集管內的凝結物，並迅速將 Working Solution 加入固定的 3D 細胞凝膠中 (150 μL/well)。
如有其他試劑使用，例如抗體，可與活化冷卻後的 CHP Working Solution 配製成含有 1% BSA 的 PBS 溶液進行共染。
3D 細胞凝膠與 CHP Working Solution 混合後一起在 4°C 下反應過夜。
如有其他試劑使用，例如抗體，可與活化冷卻後的 CHP Working Solution 配製成含有 1% BSA 的 PBS 溶液進行共染。
將染色後的 3D 細胞凝膠以輕輕搖動的方式在 PBS 中洗滌 4 次，每次 30 分鐘。
使用 Hoechst 33258 於室溫下反應 30 分鐘進行細胞核染色。如有使用二級抗體，可稀釋 1:100 ~ 1:200後，與細胞於室溫下反應 3 小時以上，隨後在PBS中進行 4 次洗滌，每次 30 分鐘。
使用螢光顯微鏡或共軛焦顯微鏡在距離底部蓋玻片 10-40 μm 的位置，使用 20× 或 60× 物鏡對染色完成的 3D 細胞凝膠進行成像。
In-gel Western Blot 進行 CHP probing 實驗步驟
詳細步驟可參考文獻: Chemistry, 2013, 24, 9–16.
將 0.5 μg ~ 2 μg 的 Collagen 在 SDS 緩衝液中加熱至 70°C，並透過 SDS 電泳膠分離。而後以二次水洗滌 PAGE 3 次，每次 5分鐘，以去除多餘的SDS。(可以從 PAGE凝膠中切出含有 Collagen 的區域，以減少後續染色時 CHP 的用量。)
因 CHP 的非特異性結合程度相當低，可以省略 Blocking 的步驟。
以 PBS 稀釋 F-CHP 或 R-CHP 的 Stock Solution 製備成 1 μM ~ 6 μM 的 Working Solution (1 mL)。使用帶有溫度控制的加熱器或水浴槽，將 CHP Working Solution 在 80°C下加熱 5 分鐘（無需加熱 CHP Stock Solution）。加熱後立即將 CHP Working Solution 浸入冰水浴中使溶液冷卻至室溫。回溫後的 Working Solution 可以快速離心，以收集管內的凝結物，並迅速將 Working Solution 加入裁切後的 Collagen Page 中。
在室溫避光的條件下進行雜交反應 3小時，隨後以二次水洗滌 3 次，每次 30 分鐘，以去除未結合的 CHP。
使用螢光凝膠成像儀/掃描儀來拍攝染色的膠原蛋白。凝膠還可以進一步用 Coomassie Blue 染色。
為什麼 CHP Working Solution 在加入樣本前需要先加熱才能活化？
CHP 在低溫儲存過程中，會緩慢地形成結構穩定但不具活化的三股螺旋。這種三股螺旋的 CHP 無法與 Unfolded Collagen 結合。因此，在使用 CHP Working Solution 之前，三股螺旋的 CHP 必須通過加熱解離為單體。由於CHP的三股螺旋化在低濃度下 (~ μM) 需要數小時才會發生，是以經過熱解離的 CHP 可以保持活性一段時間，用於與 unfolded Collagen 進行雜交。